Potpuno bubrenje smole
Izvažite 2,0 g slijepe Wangove smole u čistu i suhu reakcijsku epruvetu, dodajte 15 mL DMF, aktivacija na sobnoj temperaturi oko 30 min.
Uzmite prvu aminokiselinu
Na sobnoj temperaturi, filtrirajte otapalo iz prethodnog koraka kroz pješčanu jezgru i dodajte 1 mmol 5 molarni suvišak C Prva aminokiselina na kraju, 5-struki molarni suvišak DMAP, 5 molarni suvišak DIC, DMF Izvršite reakciju otapala na sobnoj temperaturi 3 h. Upotrijebite nakon završetka reakcije DMF isperite 4 ~6 puta, 5-6 puta svaki put mL. Zatim dodajte odgovarajuću količinu piridina i anhidrida octene kiseline u volumnom omjeru 1:1 i reagirajte 30 minuta. Upotrijebite nakon završetka reakcije DMF isperite 4 ~6 puta, 5-6 puta svaki put mL. (učinak: Blokirajte aktivne mikrotočke na nereaktivnoj praznoj smoli.)
Fmoc Odlazak zaštitnih skupina
Uklonite otapalo iz prethodnog koraka filtracijom usisavanjem i dodajte 10 mL 20% piperidin DMF-a. Otopina se doda smoli, N2 Miješajte 10 min. Na kraju, filtrirajte otopinu i dodajte 10 mL 20% otopine piperidin DMF-a, N2. Puhajte i miješajte 5 min. Zatim filtrirajte otopinu i ponovite ovu operaciju dvaput. DMF isprati 4 puta, isprati 2 puta metanolom, 5-6 puta svaki put mL.
Ispitivanje učinka uklanjanja ninhidrina
Izvadite malu količinu smole, isperite je tri puta metanolom, dodajte ninhidrin, KCN, po jednu kap otopine fenola, 105 stupnjeva – 110 stupnjeva Zagrijavanje 5 minuta, tamnoplavo je pozitivna reakcija, što znači da je uklanjanje završeno i da se može izvesti sljedeći korak reakcije.; Ako je bezbojan, to znači da zaštitna skupina nije u potpunosti uklonjena, te je gornju operaciju skidanja zaštite potrebno ponoviti.
Zatim druga aminokiselina i uklanjanje zaštitne skupine Fmoc
Izvažite 3 puta molarni višak C Druga aminokiselina na kraju, 3-struki molarni višak HBTU i 3-struki molarni suvišak HOBT U reakcijsku epruvetu dodajte odgovarajuću količinu DMF-a Nakon što se otopina potpuno otopi, dodajte 10-struki molarni suvišak (čista) DIEA, Reakcija na sobnoj temperaturi 40 min, koristite DMF ispiranje 4 ~6 puta, 5-6 puta svaki put mL. Uzmite malu količinu smole. Ispitajte s reagensom za otkrivanje ninhidrina i izgledat će bezbojno, zatim dodajte 10 mL 20% piperidina DMF Otopina za uklanjanje Fmoc, Učinite to dva puta po 10 min, 5 min, nakon upotrebe DMF isperite 4 puta, isperite 2 puta metanolom, 5-6 puta svaki put mL. Izvadite malu količinu smole. Koristite reagens za otkrivanje ninhidrina da biste je otkrili. Ako je detekcija plava, možete prijeći na sljedeći korak reakcije.
Analogno tome, ponovite korake 2.6 dok sinteza ne bude N Uklonite posljednju aminokiselinu na kraju Fmoc Protect baze, zatim ocijedite.
Odvajanje smole i odvajanje i detekcija čistog proizvoda
Na kraju, upotrijebite otopinu trifluoroctene kiseline za rezanje (95% TFA:2% TIS:2% EDT:1% H2O) Rezanje 2 h, filtrirajte reakcijsku otopinu usisavanjem i dobijete otopinu polipeptida trifluoroctene kiseline. Osušiti lizat dušikom što je više moguće, istaložiti eterom, centrifugirati i zatim ispirati eterom 3 sekunde. ~5 puta, dobivena je bijela krutina. Nakon otapanja u čistoj vodi, HPLC desaliti i pročistiti, zamrznuti-osušiti i istaložiti kristale, uzeti malu količinu MS analize.